Convidamos David William Provance Jr e Salvatore Giovanni De Simone, ganhadores do edital Inova Fiocruz Covid-19, para falar sobre seus projetos que se complementam na busca do desenvolvimento de uma proposta para o diagnóstico sorológico de Covid-19 de melhor sensibilidade.
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Com potencial para comercialização, os projetos dos pesquisadores David William Provance Jr e Salvatore Giovanni De Simone, do CDTS, foram um dos selecionados no edital Inova Fiocruz Covid-19. Os dois projetos se complementam por estarem centrados em duas fases distintas de comercialização da proposta para o diagnóstico sorológico de Covid-19. A abordagem traz na inovação, a maior sensibilidade, o que diminuiria consideravelmente a margem de erro dos testes sorológicos, o que é fundamental para a vigilância epidemiológica e para o enfrentamento da pandemia.
- Vocês tiveram projetos aprovados por duas chamadas diferentes no edital Inova Fiocruz Covid-19 para o desenvolvimento de uma proposta para o diagnóstico sorológico de Covid-19, o que pressupõe uma necessidade urgente de novas alternativas à utilizada atualmente. Quais são as limitações das ferramentas atuais e como a tecnologia proposta seria mais eficiente?
Os testes sorológicos são projetados para capturar e quantificar anticorpos presentes no sangue de pacientes que tiveram contato ou foram infectados com algum patógeno. Para conseguir isso, é usada uma “isca” que imita o patógeno e, quando incluída no teste, os anticorpos acabam reconhecendo e se ligando à essa “isca”. Quanto mais semelhança o antígeno tiver com a “isca”, melhores e mais precisos serão os resultados do teste.
“Nossa abordagem irá melhorar significativamente a sensibilidade gerando proteínas quiméricas projetadas especificamente para SARS-Cov2, fato que também permitirá melhorar a especificidade”.
Foram escolhidas inicialmente epítopos de duas proteínas do vírus, denominadas Spike e Nucleoproteína para desenvolver os primeiros testes. Embora os testes de diagnóstico criados com estas proteínas atendam a uma necessidade crítica do momento atual, eles não são necessariamente a melhor “isca” em termos de sensibilidade. Muitas vezes, um teste informa resultado negativo quando na verdade a pessoa é positiva. Nesse cenário, essa pessoa poderia espalhar a doença em vez de ser isolada para tratamento prevenindo a transmissão. Nossa abordagem irá melhorar significativamente a sensibilidade gerando proteínas quiméricas projetadas especificamente para SARS-Cov-2, fato que também permitirá melhorar a especificidade.
SARS-CoV-2, vírus responsável pelo Covid-19, tem sido um grande desafio. Pesquisas atuais sugerem que o novo vírus se originou de vírus que infectavam outros animais e, após sofrerem várias mutações acabaram se adaptando aos humanos por um evento desconhecido. Essa transferência deu início à pandemia atual no final de 2019. Como um patógeno emergente, não existiam ainda conhecimentos anteriores suficientes para desenvolver testes sorológicos de forma rápida, e a urgência era crítica porque é um vírus altamente contagioso.
Partindo então de um ponto zero, mapeamos imunologicamente os epítopos B de várias proteínas do vírus. Encontramos proteínas que representavam boas opções para servir de “isca” para a produção dos testes num tempo muito curto. Contudo, seguimos o caminho de pesquisas descritas para outros vírus, em particular o SARS-CoV, que apresenta alto nível de similaridade.
- Proteínas quiméricas multi-epítopos seriam a chave da metodologia proposta. Como vocês definiriam essas moléculas e sua função diagnóstica?
O termo quimérico deriva de quimera, que na mitologia grega significava monstro com cabeça de leão, corpo de cabra e cauda como uma serpente. Na biologia, hoje o termo é usado para descrever uma proteína que é criada pela combinação de várias partes de diferentes outras proteínas. Passamos os últimos anos desenvolvendo e patenteando um receptáculo proteico que serve como núcleo básico para criar proteínas quiméricas, “o leão da quimera”.
Da Covid-19, escolhemos os epítopos (regiões de proteínas) que apresentavam as interações mais fortes com os anticorpos de pacientes, e os acomodamos no nosso receptáculo. Essa abordagem nos permite construir proteínas quiméricas que terão a versatilidade de funcionarem como excelentes “iscas” para testes sorológicos com a capacidade de capturar um grande número de anticorpos. Isso se dá porque podem mimetizar 10 ou mais segmentos de proteínas virais concentradas em uma única proteína. Para ter uma comparação, os testes atuais representam apenas uma proteína.
- Como vocês explicariam o funcionamento dos testes diagnósticos propostos?
O sistema imunológico gera anticorpos contra qualquer patógeno estranho, seja um vírus, bactéria ou parasita. Quando a isca utilizada num teste sorológico é um componente natural do patógeno, como uma proteína inteira, no caso, do SARS-CoV-2, o resultado do teste é um sinal positivo ou negativo. Isto é, o indivíduo tem ou não tem anticorpos. No entanto, se começarmos a desconstruir os componentes naturais do patógeno, pode-se ver que há muito mais informações disponíveis. Por exemplo, existem três principais classes de anticorpos, IgM, IgG e IgA, e cada um destes anticorpos pode reconhecer e se ligar em diferentes sub-regiões de uma mesma proteína antigênica. Os anticorpos IgM são produzidos mais cedo do que os anticorpos IgG e desaparecem próximo ao final de duas semanas de infecção. Ao passo que, os IgG são mais duradouros e, em muitas patologias, por toda a vida.
As células primordiais que as produzem passam a armazenar uma memória para responder mais rapidamente a futuras infecções. Os anticorpos IgA são responsáveis pela imunidade das mucosas e, portanto, além de serem encontradas no sangue são encontrados em líquidos orgânicos do nariz, boca, garganta, pulmões, trato digestivo, leite materno, colostro, lágrima e líquor (líquido que protege o cérebro e a medula espinhal), bem como em secreções genitais e urinárias.
Além disso, as proteínas virais possuem regiões importantes responsáveis pela patogenicidade e infecciosidade. Neste momento, as regiões mais importantes são os locais reconhecidos por anticorpos neutralizantes.
Durante a busca por regiões do vírus para construir as quimeras não examinamos apenas a força de sua ligação aos anticorpos, mas também examinamos qual subtipo de anticorpo eles se ligam, e procuramos analisar também as regiões importantes do vírus que exercem função fisiológica de penetração e infecção de células de uma pessoa.
Temos planos de criar um painel de quimeras que dará uma gama de informações, como: “Uma pessoa que tem altas concentrações de anticorpos IgM, sugere que ela está nos estágios iniciais da infecção e pode transmitir o patógeno?” “Têm alta concentração de anticorpos IgG e baixa de IgM, poderia sugerir que o paciente já ultrapassou a fase infecciosa?” “Eles têm anticorpos IgA de proteção de infecções pelo nariz, boca e intestino?” “Têm anticorpos neutralizantes, fato importante que pode indicar que o indivíduo está protegido?”.
- O desenvolvimento dessa tecnologia diagnóstica em Covid-19 conta com o protagonismo de ambas equipes coordenadas por vocês. São dois projetos que se complementam em suas etapas. Um projeto depende da resposta do outro para dar início à pesquisa proposta? Como funciona essa parceria no projeto?
“(...) estamos trabalhando dentro de uma entidade pública sem fins lucrativos, visando o desenvolvimento de testes que possam agregar outros materiais de baixo custo e consequentemente, fornecerá testes com os preços mais baixos possíveis”.
Os dois projetos se complementam, por estarem centrados em duas fases distintas de comercialização. Um grupo trabalha em uma etapa upstream para gerar o painel de proteínas quiméricas, os protocolos para sua produção e uma avaliação inicial de seu desempenho.
O outro trabalha em uma etapa de downstream, identificando inicialmente os epítopos mais promissores. Além de ter interesse posterior no desenvolvimento de testes com uma única proteína com perfil de atuação que atenda às necessidades do SUS, e gerar protótipos de testes diagnósticos.
Nossos grupos estão em contato constante e compartilham todas as informações e dados em tempo real, fato que aprimora as decisões subsequentes de ambos grupos em seus projetos.
- Sabemos que o diagnóstico em massa é fundamental e consequentemente o acesso a baixo custo é mandatório para sua implementação. Nesse sentido, há alguma previsão de custo?
Um fator significativo que influencia o preço final de um teste diagnóstico no setor privado é o tempo de desenvolvimento necessário para gerar e avaliar com sucesso novos reagentes diagnósticos. Nossa abordagem acelera muito a velocidade de desenvolvimento dos testes de anos para meses, fato que reduzirá custos. Além disso, estamos gerando proteínas quiméricas únicas que podem ser produzidas por tecnologias recombinantes mais baratas amplamente disponíveis. Por último, estamos trabalhando dentro de uma entidade pública sem fins lucrativos, visando o desenvolvimento de testes que possam agregar outros materiais de baixo custo e consequentemente, fornecerá testes com os preços mais baixos possíveis.
- Rapidez também tem sido outro parâmetro perseguido tanto na obtenção do resultado após coleta da amostra, quanto na implementação de nova tecnologia. Como o projeto proposto por vocês atenderia essa questão?
”(..) o principal objetivo de nossos grupos é transformar esse conhecimento numa plataforma tecnológica de criação e produção de novos reagentes imunológicos, com alto desempenho para atender a demanda atual e futuras da melhoria da saúde da população brasileira”.
Nossas proteínas quiméricas podem ser usadas para aplicação em uma variedade de plataformas de geração de testes como ELISA, que é usado em laboratórios centrais e de referência; além de testes de fluxo lateral, que são os formatos de teste rápido tipo point of care mais comuns, bem como novas outras tecnologias “tipo teste rápido”.
- Além do uso em Covid-19, essa ferramenta poderia ser utilizada para o diagnóstico de outras doenças infecciosas?
Sim, na verdade a ideia do receptáculo proteico foi inicialmente concebida para melhorar a detecção de infecções pelo Trypanosoma cruzi, agente causadoras da doença de Chagas. Entretanto, hoje, o principal objetivo de nossos grupos é transformar esse conhecimento numa plataforma tecnológica de criação e produção de novos reagentes imunológicos, com alto desempenho para atender a demanda atual e futuras da melhoria da saúde da população brasileira.
- Colaborações internas são muito incentivadas e fundamentais no desenvolvimento tecnológico. Existem outros estudos não relacionados à Covid-19 em colaboração entre vocês?
Acreditamos fortemente na ciência colaborativa e atualmente trabalhamos com outros membros do CDTS/Fiocruz, além de pesquisadores do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), Instituto Carlos Chagas (ICC/Fiocruz), UFRJ e UFF, no Brasil. Também iniciamos colaboração com o Centro de Controle de Doenças e o Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências para desenvolver reagentes diagnósticos para a China.
- Assumindo o grande potencial e versatilidade dessa abordagem, já existe a intenção de estabelecer alguma parceria para investimento nessa tecnologia?
Até o momento, já recebemos apoio financeiro de diversos órgãos públicos. Isso inclui duas bolsas INOVA para COVID19, uma bolsa da FAPERJ, EMBRAPII e uma bolsa do BRICS.
Por Fernanda Fonseca e Gardênia Vargas
Equipe de Comunicação do CDTS
